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Regulating ABA signalling using mechanisms that control the mid-life and activity of the PYR/Pyl receivers

Thesis

Spanish

ID: <http://hdl.handle.net/10251/172364>

Abstract

[ES] El crecimiento de las plantas se ve afectado por el estrés abiótico, sequía, salinidad o altas temperaturas. La transducción de señales de estrés abiótico es fundamental para generar una respuesta fisiológica adecuada, que implica la participación de diferentes hormonas vegetales, siendo el ácido abscísico (ABA) el regulador hormonal crítico en la regulación de la respuesta de la planta a situaciones de estrés por déficit hídrico. La vía de señalización de ABA y los componentes principales están bien caracterizados molecular y bioquímicamente. Los receptores de ABA "Pyrabactin Resistance 1"(PYR)/"PYR1-LIKE" (PYL)/ "Regulatory Component of ABA Receptor" (RCAR) juegan un papel importante en la regulación cuantitativa de la señalización ABA tanto en semillas como en tejidos vegetativos. Aunque la función bioquímica de los receptores PYR/PYL/RCARs de ABA, está bien caracterizada, se conoce poco sobre otros aspectos con relevancia biológica, como sus modificaciones postraduccionales o la regulación de su vida media. Uno de los avances recientes en este campo ha sido el descubrimiento de una nueva familia de E3 ligasas llamadas RSL1/RFAs ("RING-finger-ABA-related") que consta de al menos 10 miembros, reguladores clave de la estabilidad de los receptores PYR/PYL/RCAR de ABA en tejidos de raíces y hojas, regulando su degradación en diferentes ubicaciones celulares. Un estudio detallado de esta familia génica reveló que RSL1/RFA se caracterizan estructuralmente por la presencia de tres dominios RING putativos en tándem, denominados "RING1-IN BETWEEN RING-RING2" (RBR), y en consecuencia pertenecen a la familia de E3 ligasas de tipo RBR. Cinco miembros de la familia RSL1/RFA, RSL1 y RFA6-RFA9, contienen un dominio TM en el extremo C-terminal, lo que sugiere que RFA6-RFA9 también se localizan en la membrana plasmática. Sin embargo, otros miembros de las E3 ligasas como RFA1-RFA5 carecen del dominio TM C-terminal y su caracterización funcional, así como su ubicación celular, aún no se conocen. Nosotros mostramos que la E3 ligasa RFA1 se localiza en núcleo y citosol, mientras que RFA4 muestra una localización específica en el núcleo promoviendo la degradación nuclear de los receptores ABA. Por lo tanto, los miembros de la familia RSL1/RFA interactúan con los receptores ABA en la membrana plasmática, el citosol y el núcleo, dirigiéndolos a su degradación a través de la vía endosomal/vacuolar (en el caso de RSL1) o el proteosoma 26S (para RFA1 y RFA4). Proporcionamos información sobre la función fisiológica de estas E3 ligasas de tipo RBR. Realizando tanto mutagénesis como ensayos bioquímicos para identificar la cisteína 361 (Cys361) en RFA4 como la Cys del sitio activo, que es una característica distintiva de las E3 ligasas de tipo RBR. Demostramos mediante análisis de inmunotransferencia del mutante con pérdida de función de rfa1rfa4 que los niveles endógenos de los receptores de ABA PYR1 y PYL4 aumentan en comparación con las plantas de tipo silvestre. Hemos identificado una enzima E2, "Ubiquitin Conjugating Enzyme 26" (UBC26), como la enzima nuclear canónica E2 que interactúa con la E3 ligasa RFA4 y forma complejos UBC26-RFA4-Receptor, formando agregados nucleares. Generamos alelos ubc26 con pérdida de función que mostraban una mayor sensibilidad a ABA y acumulación de receptores ABA en comparación con el tipo silvestre. En definitiva, hemos revelado un sofisticado sistema de ubiquitinación de receptores ABA en diferentes ubicaciones subcelulares llevado a cabo a través de la familia de E3 ligasas RSL1/RFA de tipo RBR. Por otro lado, hemos iniciado pruebas bioquímicas para identificar la S-acilación en el dominio TM de RSL1. Generando RSL1C334S, RSL1 C5S y RSL1C6S mediante mutagénesis y RSL1ΔTM que presenta una delección del dominio TM. Los estudios iniciales han demostrado que los residuos de Cys cercanos al dominio TM están S-acilados. Finalmente, generamos nu Fernández López, MA. (2021). Regulación de la señalización del ABA mediante mecanismos que controlan vida media y actividad de los receptores PYR/PYL [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172364

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